文章目录

摘要

Abstract

前言

参考文献

第一部分 调肾通络方防治IUA术后再粘连的临床疗效

1 研究对象

2 研究方法

3 结果

4 讨论

5 结论

附图

参考文献

第二部分 IUA纤维化程度及与TGF- β1/Smads信号通路的相关性

1 材料及方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

第三部分 动物实验

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

第四部分 细胞实验

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

创新点、不足与展望

创新点

不足与展望

综述 宫腔粘连中西医发病机制及术后再发粘连防治研究进展

参考文献

附录

中英文缩略词表

临床病例观察表

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

个人简介

文章摘要:目的1.通过临床对照研究,观察调肾通络方防治重度IUA术后再粘连的临床疗效,以期为IUA患者提供一种简便、实用且有效的治疗方法。2.通过对IUA患者子宫内膜病理切片进行回顾性分析,明确IUA纤维化程度以及TGF-β1/Smads信号通路与IUA发生发展的相关性。3.经SD大鼠IUA模型体内实验,在组织水平从TGF-β1/Smads信号通路角度,分析调肾通络方防治IUA术后再粘连的疗效机制及作用靶点。4.经SD大鼠ESCs体外实验,在细胞水平从TGF-βl/Smads信号通路角度,分析调肾通络方防治IUA术后再粘连的疗效机制及作用靶点。方法1.随机对照观察调肾通络方防治重度IUA术后再粘连的临床疗效选取2019年4月至2020年12月在云南中医药大学第一附属医院(云南省中医医院)妇科就诊患者,按照纳入标准纳入重度IUA患者60例,随机分为治疗组和对照组(n=30)。治疗组平均年龄29.87±4.06岁,平均病程3.53±1.70月;宫腔操作次数为2.10±0.0.71次,宫腔粘连评分为15.33±6.78。对照组平均年龄29.30±3.23岁,平均病程3.73±1.80月;宫腔操作次数为1.87±0.68次;宫腔粘连评分为14.93±6.50;两组患者年龄、病程、宫腔操作次、宫腔粘连评分差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组予调肾通络方治疗,对照组予芬吗通治疗,两组均治疗3个月经周期,经期停药,随访半年。采用以下指标评价各组疗效:术后3个月宫腔粘连评分,排卵日子宫内膜厚度以及PI、RI,月经量、色、质,腹痛、腰酸、焦虑等症状积分。2.IUA子宫内膜纤维化程度以及TGF-β1/Smads信号通路与IUA的相关性随机调取2018年1月至2019年5在云南中医药大学第一附属医院(云南省中医医院)妇科就诊的IUA患者子宫内膜内膜组织病理切片30例(轻、中、重各10例);非粘连子宫内膜病理切片10例,为同期因宫内膜增厚行宫腔镜刮宫术,且内膜组织病检证实为子宫内膜单纯性增生10例。采用HE染色进行腺体计数,Masson染色评估胶原纤维面积明确IUA纤维化程度;免疫组化法检测与TGF-β1/Smads信号通路相关的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7表达水平,证实TGF-β1/Smads信号通路与IUA发生发展的相关性。3.动物实验采用双重损伤法构建稳定的SD大鼠IUA动物模型,随机分为5组:正常对照组、模型对照组、调肾通络方低剂量组(2.875g/kg TTR)、中剂量组(5.75g/kg TTR)以及高剂量组(11.5g/kg TTR)。每组5只大鼠(每组共计10个子宫标本)。正常对照组、模型对照组常规喂食,喂食方法同给药组,并予给药组同等剂量生理盐水灌胃。调肾通络方低、中、高剂量组分别予调肾通络方免煎颗粒2.875g·kg-1、5.75g·kg-1、11.5g·kg-1灌胃8周。获取内膜标本,HE及Masson染色观察各组子宫内膜形态、腺体计数以及胶原面积,分析调肾通络方对SD大鼠IUA子宫内膜纤维化进展的影响;免疫组化检测Vimentin表达水平,分析调肾通络方对SD大鼠IUA子宫内膜细胞增殖的影响;qPCR法检测各组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7mRNA 表达水平,Western Blot 法检测 TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白表达水平,从TGF-β1/Smads角度分析调肾通络方防治IUA术后再粘连的作用机制及靶点。4.细胞实验提取SD大鼠ESCs,细胞培养48h后,随机分为5组:正常对照组、模型对照组、5%、10%、20%调肾通络方含药血清组。正常对照组常规胎牛血清培养。模型对照组、肾通络方含药血各组以50ng/ml TGF-β1作用于ESCs 48h,之后模型对照组加入常规饲养大鼠血清,调肾通络方各组分别加入5%、10%、20%调肾通络方含药血清。各组于37℃培养箱中培养72h,收集上清液和细胞。qPCR检测各组Smad2、Smad3、Smad7mRNA表达水平;Western Blot 检测 Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7 蛋白表达水平,在细胞水平从TGF-β1/Smads角度分析调肾通络方对ESCs的影响。结果1.临床疗效治疗3个月经后期后,治疗组宫腔镜粘连评分、排卵日子宫内膜厚度、PI、RI、症状积分分别为 5.67±3.04、8.64±1.38、0.77±0.14、0.49±0.04、32.00±7.93。对照组宫腔镜粘连评分、排卵日子宫内膜厚度、PI、RI、症状积分分别为8.57±3.93、7.08±1.83、0.96±0.14、0.53±0.04、38.00±7.85。两组治疗前后各项指标均较治疗前改善,差异显著(P<0.05)。与对照组比较,治疗组粘连评分、排卵日子宫内膜厚度、PI、RI、症状积分明显改善,优于对照组,差异显著(P<0.05)。治疗组防治IUA术后再粘连总有效率为83.3%,对照组总有效率为53.3%,治疗组明显优于对照组,差异显著(P<0.05)。2.IUA纤维化程度及与TGF-β1/Smads信号通路的相关性(1)各组子宫内膜腺体计数:HE染色结果显示非粘连组腺体丰富,呈圆形或长椭圆形,计数为48.13±6.55。粘连组腺体稀少,轻、中、重度粘连腺体计数分别为24.8±2.15、18.7±1.34、12.1±2.08。与对照组比较,粘连组腺体计数明显下降,差异显著(P<0.001),且与粘连程度呈负相关。(2)各组子宫内膜胶原纤维面积比:Masson染色结果显示非粘连组组蓝染区域不明显,胶原纤维面积小,面积比率为0.489±0.241。粘连组可见明显蓝染区域,胶原纤维面积广泛,轻、中、重度粘连面积比率分别为12.92±5.054、25.82±2.636、32.5±6.969。与对照组比较,粘连组胶原纤维面积明显增加,差异显著(P<0.001),且与粘连程度呈正相关。(3)各组子宫内膜组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7表达:免疫组化结果显示TGF-β1在各组子宫内膜腺上皮和间质均有表达,但主要表达于腺上皮细胞。非粘连组、轻、中、重度粘连组 TGF-β1 相对表达量分别为 1.37±0.49、2.90±0.31、3.80±0.42、4.50±0.42。与非粘连组比较,粘连组TGF-β1表达明显上调,并与粘连程度呈正相关,差异显著(P<0.01)。Smad2在各组子宫内膜腺上皮和间质均有表达。非粘连组、轻、中、重度粘连组其相对表达量分别为 2.77±0.43、4.80±0.42、5.00±0.47、5.00±0.47。与非粘连组比较,粘连组 Smad2表达明显上调,差异显著(P<0.01),但与粘连程度无明显相关(P>0.05)。Smad3在非粘连组中主要表达于腺上皮,在粘连组中,腺上皮、间质均有表达。非粘连组、轻、中、重度粘连组Smad3相对表达量分别为1.97±0.56、3.30±0.67、3.70±0.82、4.40±0.52。与非粘连组比较,粘连组表达明显上调,差异显著(P<0.01),并与粘连程度呈正相关。Smad7在各组中均有表达。非粘连组、轻、中、重度粘连组Smad7相对表达量分别为3.87±0.86、3.80±0.63、3.10±0.88、1.80±0.42。与非粘连组比较,粘连组表达明显下调,差异显著(P<0.01),并与粘连程度呈负相关。3.动物实验(1)各组SD大鼠子宫大体解剖形态:各组在体子宫呈“Y”型子宫。正常对照组双侧子宫对称,粗细均匀相当,子宫壁光滑,呈淡红色,色泽光鲜,有较好的弹性。模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组子宫外形相似,但均有不同程度变形、僵硬,与周边组织粘连,其中以模型对照组、调肾通络方低剂量组最为明显,而调肾通络方中、高剂量组子宫弹性尚好,粘连程度较模型对照组、调肾通络方低剂量组低。(2)各组SD大鼠子宫内膜Vimentin免疫组化:免疫组化(IHC)检测结果显示在正常对照组、调肾通络方高、中剂量组均可见大量棕黄色颗粒沉积,Vimentin阳性表达相对量分别为21.71±1.88%、17.67±1.06%、15.39±1.53%。模型对照组、调肾通络方低剂量组则见较少棕色颗粒,其相对表达量分别为6.11±0.66%、11.92±1.74%。与正常对照组比较,模型对照组、调肾通络方低剂量组呈低表达,差异显著(P<0.01)。与模型对照组比较,调肾通络方高、中剂量组表达明显上调,差异显著(P<0.01)。(3)各组SD大鼠子宫内膜组织HE染色结果及腺体计数:正常对照组子宫内膜线完整,上皮细胞结构完整,内膜间质中见丰富圆形、椭圆形腺体,呈排列状、簇状,内膜表面可见腺体开口。模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组均不同程度出现内膜组织坏死,腺体稀少、甚至缺失,其中以模型对照组、调肾通络方低剂量组最为严重。正常对照组、模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组各组腺体计数分别为54±5个/HP、10±2个/HP、20±4个/HP、34±6个/HP、50±3个/HP。与正常对照组比较,各组腺体计数均不同程度减少,差异明显(P<0.01)。与模型对照比较,调肾通络方组腺体计数呈剂量依赖性增加,但调肾通络方低剂量组与模型对照组无差异(P>0.05),中、高剂量组与模型对照组差异显著(P<0.01)。(4)各组SD大鼠子宫内膜Masson染色结果及纤维化面积:正常对照组、调肾通络方高、中剂量组见少量蓝色胶原纤维,纤维化面积比分别为13.73±1.67%、18.56±1.69%、28.38±2.8%。在模型对照组、调肾通络方低剂量组均可见大量蓝色胶原纤维,其纤维化面积比率分别为53.09±3.46%、41.82±2.89%。与正常对照组比较,模型对照组、调肾通络方各组纤维化面积增加,差异显著(P<0.01)。与模型对照组比较,调肾通络方中、高剂量组纤维化面积减少,差异显著(P<0.01)。调肾通络方低剂量组与模型对照组无差异(P>0.05)。(5)各组 SD 大鼠子宫内膜 TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7mRNA 表达:qPCR 检测结果显示正常对照组、模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组TGF-β1mRNA表达相对量分别为 2.64±0.35、4.61±0.66、4.07±0.38、3.92±0.42、3.13±0.41;Smad2mRNA 表达相对量分别为 2.96±0.33、3.83±0.55、3.64±0.57、3.28±0.67、3.00±0.53;Smad3mRNA 表达相对量分别为 3.17±0.22、4.75±0.53、4.14±0.26、3.71±0.28、3.27±0.41;Smad7mRNA 表达相对量分别为 5.82±0.33、4.03±0.19、4.60±0.62、4.69±0.47、5.76±0.27。与正常对照组比较,各组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达上调,Smad7 mRNA表达下调,差异显著(P<0.01)。与模型对照组比较,调肾通络方各组TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA呈剂量依赖性表达下调,Smad7mRNA表达上调。其中以中、高剂量组与模型对照组差异显著(P<0.01),低剂量组与模型对照组表达水平无明显差异(P>0.05)。(6)各组SD大鼠子宫内膜TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3/7蛋白表达水平:Western blot检测结果显示显示正常对照组、模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组,TGF-β1 蛋白表达相对量分别为 0.177±0.08、0.808±0.045、0.584±0.054、0.411±0.164、0.206±0.025;p-Smad2 蛋白表达相对量分别为 0.126±0.017、0.728±0.370、0.587±0.043、0.281±0.021、0.159±0.027;Smad2 蛋白表达相对量分别为 0.281±0.014、0.780±0.035、0.559±0.057、0.312±0.030、0.276±0.047;p-Smad3 蛋白表达相对量分别为 0110±0.013、0.782±0.133、0.558±0.059、0.290±0.027、0.167±0.014;Smad3 蛋白表达相对量分别为0.134±0.015、0.570±0.059、0.458±0.032、0.267±0.031、0.162±0.018;Smad7 蛋白表达相对量分别为 0.448±0.030、0.096±0.021、0.131±0.018、0.188±0.019、0.198±0.057。与正常对照组比较,各组 TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3 蛋白表达上调,Smad7 表达下调,差异显著(P<0.01)。与模型对照组比较,调肾通络方各组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达呈剂量依赖性表达下调,Smad7表达上调。其中以中、高剂量组与模型对照组差异显著(P<0.01),低剂量组与模型对照组表达水平无明显差异(P>0.05)。4.细胞实验(1)SD大鼠原代ESCs的分离、培养及鉴定:刚分离的ESCs大小不一,形态各异,多呈圆形、锥形以及多角形。培养0.5 h左右开始贴壁,培养24h后细胞呈梭形、三角形、多角形,分散排列,无明显规律。48h后细胞增多,开始出现聚集现象。培养72h后细胞明显聚集现象,多呈现梭形。vimentin免疫荧光呈绿色为阳性,阳性率为90.10±0.15%。(2)各组SD大鼠ESCs形态及密度:正常对照组、20%调肾通络方含药血清组ESCs外形相似,呈圆形或椭圆形,细胞饱满,呈铺路石状密集排列;模型对照组、5%、10%调肾通络方组细胞不同程度变细长,细胞密度下降。(3)各组SD大鼠ESCs Smad2、Smad3、Smad7mRNA表达:qPCR结果显示正常对照组、模型对照组、5%、10%、20%调肾通络方含药血清组Smad2mRNA表达相对量分别为 3.981±0.510、5.040±0.210、4.997±0.323、4.539±0.241、4.070±0.265;Smad3mRNA 表达相对量分别为 3.539±0.137、5.014±0.321、4.819±0.330、4.318±0.368、3.792±0.475;Smad7mRNA 表达相对量分别为 5.614±0.250、4.508±0.451、4.681±0.074、4.894±0.085、5.257±0.370。与正常对照比较,模型对照组、调肾通络方含药血清各组Smad2、Smad3 mRNA表达不同程度上调,Smad7表达下调。与模型对照组比较,调肾通络方含药血清组Smad2、Smad3 mRNA表达呈剂量依赖性下调,而Smad7的表达上调,其中以中、高剂量组与模型对照组差异显著(p<0.05),低剂量组与模型对照组差异不明显(p>0.05)。(4)各组SD大鼠ESCs p-Smad2/3、Smad2/3/7蛋白表达:Western blot检测结果显示:正常对照组、模型对照组、5%、10%、20%调肾通络方含药血清组p-Smad2蛋白表达相对量分别为 0.151±0.016、0.850±0.035、0.730±0.029、0.690±0.024、0.621±0.023、Smad2 蛋白表达相对量分别为 0.190±0.019、0.862±0.028、0.812±0.031、0.681±0.026、0.610±0.028;p-Smad3 蛋白表达相对量分别为 0.130±0.011、0.911±0.027、0.751±0.022、0.660±0.021、0.592±0.027;Smad3 蛋白表达相对量分别为 0.161±0.018、0.841±0.019、0.720±0.025、0.632±0.019、0.492±0.018;Smad7 蛋白表达相对量分别为 0.730±0.035、0.150±0.011、0.261±0.018、0.381±0.029、0.550±0.016。与正常对照组比较,模型对照组、调肾通络方含药血清各组p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3蛋白表达不同程度上调,Smad7蛋白表达下调。与模型对照组比较,调肾通络方含药血清组p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3蛋白表达呈剂量依赖性下调,而Smad7的表达上调,其中以中、高剂量组与模型对照组差异显著(p<0.05),低剂量组与模型对照组差异不明显(p>0.05)。结论1.调肾通络方应用于重度IUA术后,能明显改善患者月经量、焦虑、倦怠、腰膝酸软等不适临床症状;增加子宫内膜厚度,改善子宫内膜血流,促进子宫内膜修复,有效防治重度IUA术后再发粘连。2.IUA的病理本质为子宫内膜纤维化,纤维化进展参与了 IUA的发生发展,且内膜组织纤维化程度与粘连程度呈正相关;TGF-β1/Smads信号通路激活参与了 IUA的发生、发展。3.从TGF-β1/Smads纤维化信号通路角度,调肾通络方防治IUA术后再粘连可能的疗效机制为:从子宫内膜细胞到组织下调TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表达,上调Smad7蛋白及mRNA表达,从而调控TGF-β1/Smads信号通路,改善子宫内膜纤维化。